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本试剂盒基于Bradford法，用于样品中蛋白浓度的测定，检测速度很快，少量样品一般只需10min即可完成检测，检测浓度下限达到25μg/mL，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1～20μL，在50～1000μg/mL浓度范围内有较好的线性关系。

在酸性乙醇溶液中，考马斯亮蓝G250与蛋白结合颜色由棕色变为蓝色，溶液的最大吸收峰从465nm迁移到595nm，颜色的变化与蛋白浓度成正比，因此，可通过检测595nm处的吸光度对溶液中蛋白浓度进行测定。

目前，最常用的蛋白浓度检测方法是BCA法和Bradford法。与蛋白浓度测定的其他方法相比，Bradford法更简单、更稳定、兼容性更好。Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，尤其是还原剂的影响。样品中β-巯基乙醇的浓度可高达1M，DTT的浓度可高达5mM，但本法受高浓度去垢剂的影响明显，需确保SDS低于0.01%，Triton X-100低于0.05%，Tween 20、60、80低于0.015%。含高浓度去污剂的蛋白定量，建议采用BCA法蛋白浓度测定试剂盒。

• 酶标仪或分光光度计、96孔板或比色杯、离心机、离心管。
  
• 蒸馏水、0.9% NaCl或PBS。

• G250染色液回复至室温充分混匀后使用，有利于提高检测的灵敏度，加完G250染色液后，尽量在30min内完成吸光度的测定，防止沉淀形成后影响实验结果。
  
• 蛋白标准在全部溶解后先混匀，再稀释成一系列不同浓度的蛋白标准。
  
• 待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中，否则待测蛋白与蛋白标准所含非蛋白成分不一致，有可能导致测定不准确。
  
• 建议每次测定都做标准曲线。因为测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则如需精确测定宜每次都做标准曲线。
  
• 如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的最小检测体积。应按比例适当加大G250染色液、样品和标准品的用量使总体积不小于最小检测体积，使用分光光度计测定蛋白浓度时，每个试剂盒可以测定的样品数量可能会显著减少。
  
• 用比色杯测定蛋白含量时，由于考马斯亮蓝易结合石英比色杯，应优先选用一次性塑料比色杯，如用玻璃比色杯，比色完毕后应立即用乙醇清洗干净。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 蛋白标准品的准备
  
  • 取1mL蛋白标准配制液加入到20mg蛋白标准BSA中，充分溶解后配制成20mg/mL的蛋白标准溶液，配制后可立即使用，溶解后的蛋白标准溶液应-20℃长期保存。
    
  • 取适量20mg/mL蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/mL或所需浓度。例如取25μL 20mg/mL蛋白标准，加入975μL稀释液，充分混匀，即可配制成0.5mg/mL蛋白标准。
    
    • 待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中。但为了简便起见，一般也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。稀释后的0.5mg/mL蛋白标准可以-20℃长期保存。
• 蛋白浓度的测定
  
  • 将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板或EP管中，加标准品稀释液补足至20μL，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。
    
  • 加适当体积样品到96孔板或EP管中。如果样品不足20μL，加标准品稀释液补足到20μL，需注意记录样品体积。
    
  • 各孔加入200μlG250染色液，室温放置3～5min。
    
  • 酶标仪或分光光度计测定595nm波长处的吸光度（OD值），如无595nm，560～610nm波长范围的吸光度也可。
    
  • 根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线。依据标准曲线和使用样品体积计算样品的蛋白浓度。